在细菌基因组DNA提取实验中，经过细致的细菌培养与采集，我们获得了充足的菌体。接下来的关键步骤是细胞裂解，旨在破坏细菌的细胞壁和细胞膜，以释放出DNA。为此，我们采用了化学与物理方法相结合的策略。首先，使用特定的酶类处理样品，这些酶能够特异性降解细菌细胞壁成分，接着通过超声波或法式压碎法进一步破碎细胞，以确保DNA的充分释放。

完成细胞裂解后，我们面临如何有效分离和纯化DNA的挑战。利用DNA在不同盐浓度和pH值下的溶解度差异，通过一系列有机溶剂提取步骤，可以有效去除蛋白质、多糖等杂质，同时保护DNA不受降解。每一步操作都需谨慎，避免剧烈的振荡，以防DNA断裂。

实验步骤

一、试剂盒组成、贮存和稳定性

1. 说明书，耗材：DNA制备管，小量滤器，2ml离心管，15ml离心管。

2. RNaseA：50mg/ml，室温保存。

3. *：50%甘油溶解*，使*浓度为50mg/ml，-20℃密闭贮存。

4. BufferS：细菌原生质制备液，加入RNaseA后，4℃密闭贮存。

5. 025MEDTA：室温密闭贮存。

6. BufferG-A：裂解液，室温密闭贮存。

7. BufferG-B：蛋白去除液，室温密闭贮存。

8. BufferDV-A：BufferDV的制备液，请参照实验准备BufferDV的配制方法，室温密闭贮存。

9. BufferDV：相分离液，室温密闭贮存。

10. BufferBV：DNA结合液，室温密闭贮存。

11. BufferW1：洗涤液，室温密闭贮存。

12. BufferW2concentrate：去盐液。使用前按试剂瓶上的体积加入无水乙醇并混合均匀，室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。

13. Eluent：25mM Tris-HCl，pH 8.5，室温密闭贮存。

二、实验准备

1. 第一次使用时，在BufferW2中按试剂瓶上的体积加入无水乙醇并混合均匀。

2. 准备BufferDV：取2ml BufferDV-A，125ml异丙醇，75ml，加入提供的250ml试剂瓶中，混合均匀。

3. 将BufferDV预冷至4℃。

4. 第一次使用试剂盒时，用50%甘油溶解*，使*浓度为50mg/ml。

5. 第一次使用试剂盒时将随试剂盒携带的RNaseA全部加入BufferS中，混合均匀。

6. 准备65℃水浴。

7. 检查BufferG-A和BufferG-B是否出现沉淀，若出现沉淀，于65℃水浴加热至沉淀完全溶解后再使用。

8. 将Eluent或去离子水加热至65℃以促进基因组DNA的充分洗脱。

三、操作步骤

1. 用2ml离心管收集10×10⁹（1ml菌液OD600为1-1.5）的细菌培养物，12000×g离心30s，弃去上清。用150μl已加入RNaseA的BufferS悬浮沉淀。确认RNaseA已加入BufferS中，并确保悬浮均匀，不应保留小的菌块，以免影响溶菌效果。

2. 加入20μl*贮存液，混合均匀，室温静置5min。

3. 加入30μl 025MEDTA（pH 8.0），混合均匀，冰浴5min。

4. 加入450μl BufferG-A，旋涡振荡15s，65℃水浴10min。

5. 加入400μl BufferG-B和1ml BufferDV（4℃预冷），用力混合，12000×g离心2min。请在实验前按照实验准备步骤2内容准备BufferDV。

6. 尽可能丢弃上相，保留相间沉淀和下相。加入1ml 4℃预冷的BufferDV，用力混合，12000×g离心2min。

7. 丢弃上相，将下相转移至滤器（滤器置于2ml离心管中）。12000×g离心1min。上相无需完全弃去，转移无色下相时偶尔混出上相可在Tip头内迅速分相，便于丢弃。有色上相务必除尽，否则会抑制DNA结合到silica膜上。

8. 弃滤器，在滤液中加入400μl BufferBV，混合均匀。

后续步骤可选择离心法或负压法进行。

A. 负压法

9A. 将制备管插到负压装置的插口上，将步骤8中的混合液移入制备管中，开启并调节负压至-20至-30英寸汞柱，吸尽管中溶液。

10A. 保持负压，加入500μl BufferW1，吸尽管中溶液。

11A. 保持负压，沿管壁四周加入700μl BufferW2，吸尽管中溶液；以同样的方法再用700μl BufferW2洗涤一次。

12A. 将制备管置于一个2ml离心管中，12000×g离心1min。

B. 离心法

9B. 将制备管置于2ml离心管中，将步骤8中的混合液移入制备管中，12000×g离心1min。

10B. 弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，加入500μl BufferW1，12000×g离心1min。

11B. 弃滤液，重复加入700μl BufferW2并离心1min的过程，再用700μl BufferW2洗涤一次。

12B. 弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，12000×g离心1min。

13. 将制备管置于洁净的15ml离心管中，在silica膜上加100-200μl Eluent或去离子水，室温静置1min。12000×g离心1min洗脱DNA。加热去离子水或Eluent至65℃将提高洗脱效率。

最终，通过乙醇沉淀法将提纯后的DNA从溶液中析出。这一过程需在低温下进行，以促进DNA的凝聚和沉淀。沉淀物经过离心收集后，用70%乙醇洗涤，以彻底去除残留的盐类和有机溶剂，这对于确保DNA的纯度至关重要。

将洗涤后的DNA沉淀晾干，并用适量的TE缓冲液溶解，得到相对纯净的细菌基因组DNA溶液。通过电泳检测，可以直观地观察到DNA条带的清晰度和完整性，以评估提取效果。至此，整个细菌基因组DNA提取实验顺利完成，这为后续的分子生物学研究奠定了坚实的基础，正如尊龙凯时人生就博所强调的那样，科学实验应具备严谨和高效的作风。