ELISA，全称酶联免疫吸附剂测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），是一种继免疫荧光和放射免疫技术后发展的免疫酶技术。要成功开发ELISA方法，关键在于合理选择和搭配所需试剂和耗材。对试剂耗材特性及其多样性的深入了解，可以帮助研究人员在不同实验需求中寻找最优组合，从而开发出高质量的ELISA方法。

一、酶标板材

当前市场上，酶标板材主要由多（C8H8）n材料制成。具备丰富产品线的公司会对这种材料进行多种化学修饰，使其在包被蛋白时具有不同特性。一般而言，酶标板材的说明书通常依据其结合力强弱进行区分，如高结合力和中结合力。然而，基于多年的实践经验，笔者更倾向于按照亲水性等级（亲水、弱亲水、未处理、疏水）来划分和理解酶标板材的类型与特性。从一般趋势来看，酶标板材的亲水性越强，其对蛋白的结合能力也越强。例如，亲水板材的最大吸附抗体量可达220ng，而疏水板材只有100ng。随着材料由亲水向疏水变化，其对非特异性附着的能力也会增强，从而可能导致非特异信号的产生。同时，包被蛋白在酶标板材上的吸附表面往往并非均匀，可能对于某些位点产生选择性屏蔽，影响样品的检测。因此，专注于多样化ELISA方法开发的实验室应考虑准备多种不同特性的酶标板材供选择。

二、包被液

常用的包被液为PBS（pH 7.4）或碳酸钠-碳酸氢钠溶液（pH 9.6），其pH和离子浓度会对包被效率产生影响，因此需根据具体的包被蛋白特性进行优化。需要注意的是，并非所有包被蛋白都会完全吸附到酶标板材上，包被后大部分蛋白仍可能留在溶液中。有研究表明，通过抽真空处理，可以使包被蛋白以更高的密度吸附于酶标板材上。

三、封闭剂

常用的封闭剂包括3%BSA（w/v）、5%脱脂奶粉（w/v）等，其作用在于覆盖酶标板材未被包被蛋白占据的区域，以防后续样品或酶联抗体等对板材的非特异性吸附。根据我的经验，封闭剂对成分简单样品的封闭效果较佳，而对复杂样品则效果可能大打折扣。研究显示，封闭剂的封闭效果与其分子大小成反比，因此如果传统封闭剂效果不佳，可以考虑使用分子量较小的封闭剂（如酪蛋白）。此外，如果检测体系使用的是生物素-链霉亲和素体系，务必避免使用脱脂奶粉作为封闭剂，因为其含有生物素，可能干扰检测。

四、洗涤液/稀释液

洗涤液通常为中性缓冲液配合适量的去污剂，如PBST（0.05%(V/V) Tween-20 in PBS）。稀释液则在洗涤液中加入适量的封闭剂成分，常见的是0.5%BSA（w/v）在PBST中。在一些体内样品检测中，常会在稀释液中加入一定浓度的阴性血清，以确保不同稀释度样品具有一致的非特异性背景。

五、酶联抗体

酶联抗体种类繁多，可分为特异性酶联抗体和通用型酶联抗体。特异性酶联抗体靶向特定蛋白表位，通用型酶联抗体则主要针对多肽序列、生物素及特定种属抗体的Fc端保守区域等。常用的酶标记酶包括碱性磷酸酶（AP）和辣根过氧化氢酶（HRP）。根据抗体成分，酶联抗体可进一步分类为单抗和多抗酶联抗体。多抗成分通常通过免疫反应获得，成分较复杂，需注意与ELISA体系其他试剂的交叉反应。此外，酶联抗体可按分子量从大到小分为全长抗体、Fab片段和scFv。这意味着分子量较小的酶联抗体在与样品蛋白结合过程中，更可能避免被空间阻碍，但也增加了非特异性结合的风险。

六、显色液和酶标仪

显色液的选择需与酶联抗体的类型相匹配，并与实验室所使用的酶标仪对应。如果酶联抗体是HRP，则可选用TMB显色液，通过能检测吸光度的酶标仪进行读数；或者使用Ampliflu™ Red进行荧光读数，亦或是QuantaRed ADHP进行化学发光读数。一般而言，ELISA方法的灵敏度受到底物检测方法的限制，化学发光底物的信号下限通常优于荧光底物，再优于吸光度值底物。即使是像TMB这样常用的显色液，不同供应商可能提供不同显色强度的产品，因此应根据具体方法开发需求合理选择。

选择并优化合适的ELISA方法不仅能提高实验效率，还能最大程度地保证实验结果的准确性。在这一过程中，尊重各类试剂及耗材的特性尤为重要，正如尊龙凯时人生就博所倡导的，对于科学实验要始终保持严谨和细致的态度。